超聲波法破碎細(xì)胞的常見(jiàn)問(wèn)題分析如下

問(wèn)題：大腸桿菌表達(dá)外源蛋白，在超聲破碎的時(shí)候，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，然后超聲的效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對(duì)其他的一些**同樣起作用，比如鏈霉菌。在表達(dá)重組蛋白后超聲波破碎細(xì)胞，采用冰浴，400w，破碎2s停1s，但是不一會(huì)就產(chǎn)生大量泡沫，影響了破碎功率，pbs和tris緩沖液都是這樣，*后都是破碎不完全，而目的蛋白就在這些未破碎的細(xì)胞中，怎么辦？

解析：（1）會(huì)產(chǎn)生氣泡是因?yàn)樘筋^位置沒(méi)放好。

     （2）探頭一定要接近底部，約0.5-1cm。

     （3）功率根據(jù)儀器不同會(huì)有所不同，但可以觀察液面，有波動(dòng)但不要太劇烈。

     （4）可以選擇破碎3s停10s，破碎20-30次。

     （5）變幅桿位置擺放也要注意，聽(tīng)聲音如果不對(duì)的話就要及時(shí)調(diào)整。

     （6）從菌濃度方面考慮。在破碎時(shí)試著加大體積，強(qiáng)度*好不要超過(guò)60%。

     （7）嘗試破碎8s停8s，對(duì)有些菌體蛋白來(lái)說(shuō)，難散熱導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，可以停頓時(shí)間稍長(zhǎng)一些，這種情況多見(jiàn)于包涵體形式的蛋白。

問(wèn)題：鏈霉菌（放線菌）超聲破碎條件是什么？

解析：放線菌屬于原核生物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上的（G＋C）摩爾百分含量（mol％）高的革蘭氏陽(yáng)性菌（Eubacteria）分枝類群，它雖然具有原核生物特有的分子生物學(xué)特性，但在其不同類群中，細(xì)胞壁的化學(xué)組分變化很大。在做大腸桿菌超聲時(shí)，采用的是400W，破碎5s停5s的方法，效果不錯(cuò)，但是用在鏈霉菌上，由于細(xì)胞壁組成差異一般沒(méi)什么效果。

鏈霉菌（放線菌）超聲破碎前處理一般是配置成一定濃度的菌懸液。使用超聲破碎時(shí)采用的具體條件是：
    (1)取**的24h培養(yǎng)液于5 000 r／min 下離心5 min收集菌體。

(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO緩沖液洗滌3次，再用該緩沖液將菌體配成1：3的菌懸液。置于40 mL大塑料試管內(nèi)。

(3)將大塑料試管置于冰浴中，采用超聲波破碎(功率200W，1／2”探頭，破碎30s，間歇30s)。

(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷凍離心30min，收集細(xì)胞碎片和上清夜。洗滌菌體也可以用預(yù)冷的生理鹽水或pH8的Tris－HCl，洗滌一次就可以。另外，超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大，功率可以到400－600w，破碎5s，停5s，冰浴，要加終濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強(qiáng)度和次數(shù)，有必要隨時(shí)鏡檢觀察菌體是否完全破碎。

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